Mayo Chiki! merupakan anime harem yang ditambah dengan konsep cross-dressing (seseorang memakai pakaian lawan jenisnya). Bercerita tentang Sakamachi Kinjirou, siswa kelas 2 SMA yang memiliki alergi terhadap perempuan (jika disentuh atau menyentuh cewek, dia akan mimisan). Dia mempunyai teman yang bernama Konoe Subaru, seorang butler (pembantu pria) dari Suzutsuki Kanade yang juga sekelas dengan Kinjirou… Suatu hari, karena suatu kejadian yang tak disengaja, Kinjirou mengetahui bahwa Subaru adalah seorang perempuan. Majikannya, Kanade, mengatakan jika identitas Subaru ketahuan maka Subaru akan dilepas dari posisinya sebagai butler. Oleh Karena itu, Kinjirou pun berusaha menjaga identitas Subaru dan berjuang menjauhkan kejadian yang bisa mengungkapkan identitas Subaru.